作者：Zhulikou431
根据WHO专家的话说，最大的风险等于患者有病却不有医治药品。可是，要是有研发人员斥地了药品，然而要限于目前传统的法例质控要求，不能及时让患者获得救命药品，也优劣常遗憾的。
短暂以来，各国药典收载了良多评价药品制品和原辅料的微生物检测方式；这些方式为主观评价药品品质，并协助制药职员和截留人员以果决药品格量弘扬了很大的浸染。然则目前从最新观点看，大一部分药典收载的微生物检测几回再三都是传统和滞后的，因为这些检测方式需要很长工夫才可以给出最后检测结果。拿无菌检测为例，今朝世界各国药典都规则无菌药品要养育14天，而这个培育光阴对于很多癌症初期患者而言，好坏常难以忍耐的煎熬。另外，有些药品无效期很短，例如电子辐射类药物；若是对付这些药品都接纳特例微生物检测办法来武断与实施放行，患者与制药行业都要接受苦楚。
为了贪图这些抵牾，各国技术手段专家不休开发和推出倏地微生物检测手艺（R玉人）。当前，USP推出一个新的技术手段附录，详细阐释了对于效期较短的无菌药品，如何做才是更合理的。这份文件的称谓是USP-1071《RAPID MICROBIAL TESTS FOR RELEASE OF STERILE SHORTLIFE PRODUCTS: A RISK-BASED APPROACH》，翻译中文为《无效期较短的无菌产品放行的神速微生物测试-基于风险的方式》。
笔者根据自身的理解，对全文发展了翻译与解析，祈望可以为制药行业以及亟待救命药的患者提供搀扶帮助。
1、介绍
人们遍及以为，当前生长型的无菌搜查法（哺育期至少为14天）（见无菌搜查〈71〉）不适用于效期较短的产品或豫备立纵然用的产品，这些产品通常在检测完成前注入患者体内。这些短效期产品包孕分派无菌制剂（CSP）、正电子发射断层扫描（PET）产品以及细胞与基因疗法产品，它们需要新一代的基于风险的门径，包孕快速微生物测试。有关无菌检查以外有助于无菌担保因素的一样平常讨论，请拜见无菌包管〈1211〉。应留意的是，与其他替代测试法子一样，假设发生争议，仲裁采用的测试办法应当相符USP〈71〉所列门径。
假设进行微生物检测，最好在产品使用前完成检测微生物污染的测试来确保患者的保险。
疾速微生物检测（RMTs）应基于风险，这样利益相关者可选择恰当其预期用处的首选技术手段，并失调用户需求规范（URS），包罗出下场时日、奇怪性、检测限（LOD）、样本量和产品属性。好比，许多放射性药物，由于放射性示踪剂的半衰期短，通过实时微生物检测被害最多，而分派无菌制剂（CSPs）与细胞治疗产品，由于会稍微超过使用日期，因此接纳彻夜检测或至少在48小时内完成检测会使用户受害。
本章节是通常性信息，寻找了生产/制备和检测短效期产品的需求及其URS，并简明寻觅了短效期的无菌产品放行的基于风险的快速微生物检测的一些合适法子（本章下文称为"短效期产品"）。
2、无菌短效期产品放行的极快微生物测试的用户要求规范
短效期产品放行发展倏地微生物测试选择合适的妙技理应是基于风险的选择。一致武艺的URS采集：
用尽可能短的年光发生发火检测事实，最好是实时的或少于24小时，最佳是在产品给药之前；
检测才具，最幸亏测试样品中检测到少于100CFU；
能够在产品中检测多种活性微生物；
样板数目,即测试物品的最小数量与每一个测试容器的数量，不会用完大局部的可用产品；
在可行的情况下，产商应在功底设计过程中思虑检测要求
无菌测试质料处置，即开启体系，以削减测试历程中的不测污染；
可从多个提供商获得仪器与试剂；
参考尺度、阳性与阳性对照的可用性，适用于使用菌落造成单元以外信号的技艺。
易于使用/测试和数据解释简单；
假阳性和假阴性结果的发生率较低；
针对每个特定产品的法子适用性测试战略；
行进患者的平安性，首要在于：
在给药前完成测试；
提供无菌检测不合格的逐步监测和报告的测试；
能够辨认检测到的微生物，这可能对临床医生用药以及查询拜访必定其根源有用。
测试中使用的设备和试剂的耐用性和牢靠性；
样品制备适用于手动与被动办法。
3、基于风险的微生物监测与放行测试的概念
对极快微生物检测（RMT）的URS的检察诠释，需要做出一些基于风险的决定，特别是在出后果的工夫、LOD、样板量以及检测到的微生物范围方面，以便在给药前接纳此类检测。假如现行的无菌查抄不合适，利益相关者应进行风险评估以选择RMT。
得利的方面可能采集，好比：
当产品给药太晚对患者生存具备重微风险的情况下使用RMT。病例文献中的一个显著例子是血液感染，这是一种疾速进行性感染，出世率高达40%，况且每天迁延服用抗生素会导致入世率添加10%。在这些情况下，在给药前完成微生物测试显然可以提高患者的安然性。
采纳成长型的RMT，将延续读数使用于"到当前为止为阳性"的风险放行，因为可以更早地检测到极快成长的微生物，假定检测到不合格，何等让病例大夫能够更快地对患者进行过问。当检测到被感染的产品时，执行室主管可以通知治疗患者的病例大夫，并可以入手下手血管内液体复苏和抗生素医治以防范感染性休克。是以，与造就期完毕时的单个读数相比，逐渐监测并自动呈报不及格的无菌测试具有格外的上风。
使用LOD高于1 cfu的非成长型RMT，通过微生物哺养基中的生前程行扩增，但发生究竟的时间非常快。短效期产品在给药早年实时检测感染的伎俩可能会以为比在产品中检测单个菌落造成单元更必要。当思索到对患者的风险时，RMT的选择应思量到检测灵敏度与检测工夫的干系。赏析应有合理的灵敏度，以检测低水平传染物的存在，并应在产品给药前可获得结果的时间框架内发展。
非生长型RMT门径的其他利益还可能包括不受测试样品中抗生素的影响，以及检测造就阳性感染因子。一些DNA靶向抗生素（如多粘菌素B与杆菌肽）已被证实抑制了PCR扩增，而青霉素G、氯霉素、两性霉素和纳利地西酸等抗生素不影响反应的分辨才能。这对付生产抗生素注射溶液的无菌配制药房来说是最需要的。方法适用性应必然供试品中可否有抗生素会影响测定。
其它，在终极产品放行无菌搜检畴昔，可将RMTS或其他极快微生物法子（R美眉s）用于中控之中，以更快地提供有关微生物控制的无效性与对总净化的早期检测的静态（以便调查和尽快启动生产）或产品可能无菌不及格的可能性。
对付风险评估，一个可能被正视的思索因素是根据注射或注入的产品的数目和给药部位对病人的相对风险。注入体积越大，侵入性越强，患者的血流感染风险就越大。风险规模从少量的皮内注射到大批的静脉打针(见表1)。
表1. 按给药阶梯和绝对风险水准划分的模范打针量
4、用于必定无菌短效期产品放行的基于风险的极快微生物试验的关键哄骗参数
预计的垄断参数，即表2中列出的适用于RMT的备选技术的LOD、出究竟的年华以及样本量。
表2 备选的快捷微生物技术的垄断参数
对付这些方式，信号将以基因组单位透露表现。
5、〈71〉不适用于产品放行检测时样板大小的思量
根据技艺的样品处置手段或保管急需产品的需要，可能需要缩减样本大小。
每种造就基所使用的产品的最小数目以及与批量相关的待测单元的最小数量见< 71 >，表2和表3。人们遍及以为，对付大批量的制药产品，检测的单位数目其实不是基于统计的，而且在每个产品批次中检测低净化程度的本领较低。然而，跟着许多效期较短的产品的批量变小，这一制约将会减少，因为测试的产品绝对于批量的比例将会增长。
这种传统的取样计划不适用于细胞治疗产品。例如，假如准备了10个零丁的60毫升的静脉注射（IV）细胞袋，那末将取4个样品袋，每一个样品袋取20毫升。采用这种抽样方案，40%的批次将被用于无菌搜查，这不光是弘远的经济散失，而且更须要的是，医治产品的巨大散失，可能会影响对患者的足量给药剂量。相反，假设40个1毫升的西林瓶用于注射用药品4万瓶批次的无菌搜检，这只占该批次的0.1%。
削减样板量与检测单位数量将低落无菌搜查的灵敏性。表3和表4注明了对药品和分配无菌制剂（CSP）测试的绝对不飞快性。
表3 药品20单元的无菌检查通过给定的接续添加的沾染率的概率
根据以下发展总计
p = (1 - p)20= q20
p = 批次中污染的比例
q = 批次中未传染的比例
表4 无菌调配制剂（CSP）6单位的无菌搜检通过给定的不息增多的沾染率的几率
其他药典中也提出了替代的抽样计划。欧洲药典9.0章第2.6.27细胞制剂微生物学搜检中缔造了一种批量小于40个单位的细胞医治产品无菌查看的举荐方式。
容量在10 ~ 1000ml的细胞制剂的传染试验样品量为总容量的1%;容量在1 ~ 10ml的细胞制剂，样品量为0.1 mL;对付小于1ml的细胞制剂，该制剂将不进行检测。如21 CFR 610.12(无菌)中所首倡的，在彻底合理的状况下，可以使用倏地方式发展中控检测，以承办最终产品检测。
与细胞治疗制剂类似，PET放射性药物的样品量和采样计划也必需顺应有限的瓶数(通常为一个)与批次中生产的产品容量(通常小于15毫升)。假设该批次由单个容器组成，则无菌搜查样品量至多为该批次总容量的1%。比方，要是一个批次是1瓶含有15毫升，最多使用0.15毫升用于无菌搜查。假如该批次由多个容器组成，则使用单个容器的量至少占整个批次容量的1%。若是每批由3个小瓶组成，每个小瓶含有25毫升，则至少从1小瓶中取0.75毫升用于无菌查看。
检测限
在用一个或多个菌落造成单元的细胞悬浮液制备接种物的制约条件下，成长型的无菌搜检显示根据泊松分布理论检出限至多为1-3 cfu。对全体手艺设置装备摆设单个活细胞的LOD，对付任何无菌检查门径来说凡是设置了不实在际的使用窒碍，尤其是当旌旗灯号不是通过培育的稀释而放大的菌落造成单元时。
检测多种微生物的才智
尽管全数的综合平台都应能够检测各种各式的细菌、酵母菌和霉菌，但证实极快微生物检测（RMT）选择的妙技能够检测与无菌查看不及格、迸发感染以及与CSP、喷射性药物、细胞疗法或制剂相关的产品调派有关的微生物，这一点利弊常紧要的。风险剖析后，假定该手艺显示能够通过向独立利益相关患者给药，并前进患者的保险性，则情况尤其如此。
6、无菌短效期产品放行疾速微生物检测法子
根据与上文计议的URS的娶亲状况，适用于RMT推荐的技术，按字母顺序列出如下：
o三磷酸腺苷（ATP）生物发光
o流式细胞术
o恒温微量热量测定法
o核酸扩增
o呼吸
o固相细胞术
手艺简介
分别对这些备选的初级剖析平台发展了简明根究，并提供了关键参照。无关概述，请参阅Moldenhauer
三磷酸腺苷生物发光
这是一项成熟的妙技，有多种仪器制造商提供的光度计和试剂。活细胞的能量以ATP的形式储存，当征战美国萤火虫的荧光素酶时，可以以光的内容丈量。荧光素酶斲丧的每个ATP份子发生发火一个光子。
光度计检测到的终归通常以相对光单位（RLU）闪现，并且结果拜托仪器、试剂与有机体。差别微生物的ATP含量领域为革兰氏阴性菌2～4×10～18摩尔/cfu，革兰氏阳性菌5～8×10～18摩尔/cfu，真菌300～800×10～18摩尔/cfu。在微生物造就基中，由于测量的高信噪比和背景ATP，肉汤中微生物相关仪器的检测限约为5000 RLU，相等于约103CFU。
这一LOD将检测微生物的存在，其程度与目视检测哺养基成长所需的水准相比，低3-4个对数水准。无菌短效期产品放行的快速微生物试验，无论是在液体培养基中到达阈值ATP水平的稀释养育，照样在固体哺养基上的膜过滤器上构成微生物菌落的稀释作育，造就年光都可达到2-7天。
流式细胞术
流式细胞术可用于在24-48 h的浓缩培育后检测荧光标记的活菌细胞。标识表记标帜试剂由荧光基质或活菌染色剂组成，用于分辨活细胞与死细胞与细胞碎片。只管细菌极为小，可能很难从细胞碎片中判别出来，但它们可以通过大小、形态和荧光强度来甄别。细胞存活技能花样是指残缺的细胞膜保留由非神奇性细胞酯酶发生的荧光色素的才能，或用核酸独特性生命染色符号细胞。激光映射流中的每个细胞以及收回的光由双光电倍增管阵列检测。信号颠末数字化处置，并由辨认软件进行解释。该手艺的LOD多是>1 cfu并且可能需要一个浓缩步骤。
恒温微热量计
恒温微热量计监测与微生物代谢活性和成长无关的密闭小瓶（系统）的焓变卦。利用现有的仪器，104个活性微生物细胞可以释放子虚的热量进行检测况且检测需要浓缩（出毕竟需2-7天）。尽管其在无菌产品放行测试中的具体应用还没有必定，但最近它在药物微生物学中的运用也曾得到了评价。
核酸扩增妙技
实时定量聚合酶链反应（PCR）有可能通过36-48个扩增周期监测PCR的指数阶段，使用普片引物和探针（喻为"泛细菌"和"泛真菌"方式）估量目的DNA的初始数目，即反过来，与试验样品中微生物细胞的数目成比例。与DNA差别的是，细胞RNA的代谢速度迅速，可以更好地指挥活的微生物。
例如，大肠杆菌每个细胞含有2个DNA份子和2×104个16S rRNA份子。这一历程是通过酶逆转录酶将RNA转化为DNA（cDNA）的互补拷贝来实现的，cDNA可以通过定量（计数试验）或定性（无菌搜检）实时剖析。兴许，关于基于DNA的PCR，用单叠氮化物或单叠氮化物丙啶预处理的样品也可以提供鉴别活的与死的微生物细胞的威力，可能可以通过离心/洗涤程序从试验样品中去除游离的微生物DNA，包孕从阐发用细菌颗粒中去除游离的微生物DNA。
实际上，单个活细胞的LOD可能是一个不成战胜的寻衅，尤其是对于依托DNA/RNA靶和普片性引物的测试而言。
另一个搬弄是不合微生物中不合数量的基因组精神。
通常环境下，LOD在样本中范畴为10到1000个活细胞/mL，另内在一些报告病例中规模为10到100个活细胞/mL。迩来的研究批注，PCR实际上可以在不需要在微生物成长养育基中预养育的环境下，在含有高达10个哺乳动物细胞/mL的高浓度样品中检测到10 - 10 cfu/mL的微生物。增长生长型的稀释法式至多24-48 h并且对比培育先后PCR下场，可为无菌检查提供适用的图谋方案。
另外，还可以采取浓度法来富集样品，削减样本体积。如上所述的近来的一项研究的作者使用16 s rRNA PCR对干细胞发展无菌查抄,证明细菌灵敏度为10 - 100 cfu / mL,测试方式灵敏度100 cfu /毫升将适当检测临床显著细菌感染的血液和细胞制品。
成长型和核酸扩增型检测门径的直接比较是繁杂的，由于核酸扩增型检测办法也检测非活性的生物体，而且是对微生物基因组拷贝数的测量，而不是菌落形成单位。是以，核酸扩增型检测LOD应根据每毫升基因组当量来定义。
用于无菌短效期产品（如核酸扩增）放行的非成长型RMT由于以下原由可能具有其他上风：
o接近实时的检测，将在短效期产品注入患者体内前完成检测
o检测哺养阴性感染因子
o如本章后背所述，测试样本中抗生素对测试的影响最小
o与其他妙技相比，该测试对动物细胞裂解(如颗粒、ATP)发作的背景不太急速，由于特定的微生物基因是靶向的
呼吸类手艺
这一大类包括从经典呼吸计，到气体顶空阐发仪，再到积极血液培育琐屑。好氧和厌氧肉汤配方思索到了5天的造就时日内可以回收惹起血流感染的大少数微生物的收受接管率。在一些仪器中，这搜聚如〈71〉中20°-25°与30°-35°的造就。这项手艺曾经得胜地裁减到细胞治疗产品的无菌检查，采用7天的哺育作为批次放行药典无菌检查的替代法子。
其他可用于检测与计数呼吸微生物的仪器。比方，可调谐二极管激光吸收光谱（TDLAS）可以测量养育基中含有生长微生物的关闭单元中的氧（O）损耗或二氧化碳（CO）增多。该手艺一开始是为监测密闭摆设中的气体顶空成份而启示的，也可用于积极介质加添搜检。系统具有气体校准规范，如果系统用于无菌搜检（比方，对大容量容器发展校准），则需要发展较小的调停。
[注：呼吸平台的所有系统都需要微生物生长和代谢活性进行检测，即通常需要2-7天的时间才能获得结果。但是，如果结果可以逐步监测，在培养期间早先检测到无菌检查不合格，这对于上述风险评估部分所述的短效期产品是一个巨大的优势。]
固相细胞术
有基于固相细胞术的仪器零碎，散漫荧光符号与固相激光扫描，可神速计数可过滤液体中的活微生物。通过过滤0.45微米聚酯膜搜集微生物，并用后盾和活性染料发展处理。用高速488nm氩激光在细胞仪中扫描滤光片。多个光电倍增管，颠末处理以鉴识符号微生物和靠山噪声，根据大小、形态与荧光强度，检测荧光。扫描显示为一张地图，用于辨认荧光事项的地位，使用带积极天真化台的表观荧光显微镜来必然单个事件的职位。该琐屑宣称能在2-3小时内检测到单个的活微生物。应该留意的是，大少数细胞治疗产品但凡不成过滤的，于是该妙技可能与这些类型的产品不兼容。
7、方法适用性测试
生长型无菌试验的方式适用性申请见〈71〉。必须要证明每一个待测试产品的测试适用性。在残留产品具备的环境下，USP在低于100 cfu的水准上应战生物体的收受接管率，被证明为直接接种或膜过滤法的微生物成长介质中显着可见生长。除了源自实行室的菌落组成单元之外的旌旗灯号培养（比方，核酸、ATP和活微生物细胞的荧光标识表记标帜），测试实际样品的下场可能会得出与使用其他技术手段不不异的结果。然而，法子适用性测试将确认阐发物中的产品残留物不会抑制与快捷办法发生发火信号相关的酶促法度模范。
原题目：USP | 与死神竞走 极快微生物检测手艺的律例停留
